摘要

黑麥染色質(zhì)檢測(cè)對(duì)麥類作物遺傳改良至關(guān)重要。本研究利用熒光原位雜交技術(shù)（FISH），結(jié)合威尼德 HB-500 原位雜交儀，針對(duì)黑麥染色體特異性序列進(jìn)行精準(zhǔn)定位。通過設(shè)計(jì)特異性探針并優(yōu)化雜交條件，成功在根尖細(xì)胞與花粉母細(xì)胞中清晰顯示黑麥染色質(zhì)分布，為麥類遠(yuǎn)緣雜交育種及染色體進(jìn)化研究提供了高效技術(shù)方案。

一、引言

黑麥（Secale cereale）作為麥類作物重要的遺傳資源，其染色質(zhì)中蘊(yùn)含的抗病、抗逆基因是小麥品種改良的關(guān)鍵靶點(diǎn)。準(zhǔn)確檢測(cè)黑麥染色質(zhì)在種子后代中的存在與分布，是麥類遠(yuǎn)緣雜交育種的核心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法如吉姆薩染色，雖能觀察染色體形態(tài)，但難以精確識(shí)別黑麥特異性染色質(zhì)片段；分子標(biāo)記技術(shù)（如 SSR、STS）雖可鑒定遺傳物質(zhì)，卻無法直觀呈現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)與整合位點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通過熒光標(biāo)記的 DNA 探針與靶染色體序列特異性結(jié)合，能夠在細(xì)胞水平直接定位目標(biāo)染色質(zhì)，具有可視化程度高、特異性強(qiáng)、可定量分析等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)尤其適用于檢測(cè)異源染色質(zhì)在宿主基因組中的整合模式，為解析麥類作物遺傳漸滲機(jī)制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究的核心設(shè)備，為植物染色體 FISH 檢測(cè)提供了精準(zhǔn)可控的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，實(shí)現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，確保雜交過程中溫度均一性，避免因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的探針非特異性結(jié)合；全密封濕度控制系統(tǒng)維持≥90% RH 恒濕環(huán)境，有效防止雜交液揮發(fā)，提升探針與靶序列的結(jié)合效率。儀器支持全自動(dòng)變性 - 雜交一體化流程，配合 7 英寸智能觸控屏與 110 組用戶程序預(yù)設(shè)功能，顯著簡(jiǎn)化操作步驟，縮短實(shí)驗(yàn)周期，為植物染色體精細(xì)分析提供了技術(shù)保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的黑麥染色質(zhì)檢測(cè)方法，驗(yàn)證其在植物遺傳育種中的應(yīng)用價(jià)值。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 植物樣本：

• 黑麥（Secale cereale L.）品種‘冬黑麥 1 號(hào)’，由某農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，取根尖分生組織（用于體細(xì)胞染色質(zhì)檢測(cè)）及孕穗期幼穗（用于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察）。

• 對(duì)照樣本：普通小麥（Triticum aestivum L.）品種‘揚(yáng)麥 18’，用于背景信號(hào)排除及探針特異性驗(yàn)證。

2. 2. 探針：

• 黑麥特異性重復(fù)序列探針 pSc119.1（標(biāo)記為綠色熒光，激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm），靶向黑麥染色體端部異染色質(zhì)區(qū)；

• 小麥 5S rDNA 探針（標(biāo)記為紅色熒光，激發(fā)波長(zhǎng) 570 nm），用于染色體核型對(duì)照，探針由某生物科技公司合成并純化。

（二）主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括某試劑（用于細(xì)胞固定、探針稀釋及雜交緩沖液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 緩沖液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 檸檬酸鈉，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA、DAPI 復(fù)染劑（1 μg/mL）、抗熒光淬滅封片劑等，均為分析純級(jí)別。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準(zhǔn)控溫、全自動(dòng)變性 - 雜交功能，支持 12 張玻片并行處理）、熒光顯微鏡（配備 UV、綠光、紅光激發(fā)模塊）、高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、顯微操作儀、移液器、酶標(biāo)儀等。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞樣本制備

• 1. 根尖細(xì)胞：取黑麥種子萌發(fā)根尖（1-2 cm），經(jīng) 0.002 M 8 - 羥基喹啉預(yù)處理 2 h（室溫），卡諾固定液（甲醇：冰乙酸 = 3:1）固定 24 h，系列乙醇（70%、85%、100%）脫水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

• 2. 花粉母細(xì)胞：剝?nèi)『邴溤兴肫谟姿耄ㄋ腴L(zhǎng) 3-5 cm），卡諾固定液固定 24 h，梯度乙醇脫水后，取花藥置于載玻片上，滴加 1×PBS 緩沖液，鑷子輕壓破碎細(xì)胞，室溫晾干。

2. 玻片預(yù)處理與樣本變性

將固定后的根尖細(xì)胞或花粉母細(xì)胞樣本玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀，70℃烘烤 2 h 增強(qiáng)細(xì)胞粘附力。隨后依次用 2×SSC（37℃，10 min）、胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，5 min）處理以消化細(xì)胞質(zhì)蛋白，再次經(jīng) 70%、85%、100% 乙醇脫水，室溫晾干。

3. 探針制備與雜交程序

• 1. 探針混合：將 pSc119.1 探針與 5S rDNA 探針分別以 1:50 比例溶于雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鮭魚精 DNA），充分混勻后加入儀器探針槽。

• 2. 變性與雜交：?jiǎn)?dòng)威尼德 HB-500 原位雜交儀的 “全自動(dòng)雜交模式"，首先在 75℃對(duì)探針混合液變性 10 min，立即冰浴 5 min；隨后將變性后的探針滴加于樣本玻片，覆蓋蓋玻片并密封，儀器自動(dòng)升溫至 42℃預(yù)雜交 1 h，再降至 37℃進(jìn)行過夜雜交（16-18 h）。過程中儀器實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度（全域溫差≤±1℃）與濕度（≥90% RH），確保探針高效結(jié)合。

4. 洗片與信號(hào)檢測(cè)

雜交結(jié)束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未結(jié)合探針，蒸餾水漂洗后晾干。滴加 DAPI 復(fù)染劑（1 μg/mL）室溫孵育 10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。

在熒光顯微鏡下觀察，pSc119.1 探針信號(hào)呈綠色熒光，定位黑麥染色體端部；5S rDNA 信號(hào)呈紅色熒光，標(biāo)記小麥染色體核仁組織區(qū)；DAPI 復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。每個(gè)樣本隨機(jī)選取 20 個(gè)分裂相細(xì)胞，記錄熒光信號(hào)的數(shù)量、位置及強(qiáng)度。

三、結(jié)果與分析

（一）探針特異性驗(yàn)證

在普通小麥對(duì)照樣本中，僅檢測(cè)到紅色熒光信號(hào)（5S rDNA 標(biāo)記的小麥染色體），無綠色熒光信號(hào)；而在黑麥根尖細(xì)胞中，所有染色體端部均顯示強(qiáng)烈綠色熒光，與預(yù)期的 pSc119.1 探針結(jié)合位點(diǎn)一致，表明探針具有高度特異性，可準(zhǔn)確識(shí)別黑麥染色質(zhì)。

（二）黑麥染色質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

1. 1. 體細(xì)胞染色體定位：黑麥根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體顯示，每條染色體端部均存在綠色熒光信號(hào)，呈對(duì)稱分布；與小麥 - 黑麥異源六倍體種子細(xì)胞對(duì)比，可清晰分辨黑麥染色體（攜帶綠色信號(hào)）與小麥染色體（僅紅色信號(hào)），證明該方法能有效區(qū)分異源染色質(zhì)。

2. 2. 減數(shù)分裂期染色體行為：黑麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期 Ⅰ，同源染色體聯(lián)會(huì)形成二價(jià)體，綠色熒光信號(hào)集中于染色體端部，顯示黑麥染色質(zhì)在減數(shù)分裂中的穩(wěn)定傳遞；在小麥 - 黑麥種子花粉母細(xì)胞中，觀察到黑麥染色質(zhì)與小麥染色體的部分聯(lián)會(huì)現(xiàn)象，為解析遠(yuǎn)緣雜交親和性機(jī)制提供了細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能評(píng)估

• 1. 控溫精度：實(shí)驗(yàn)過程中 12 張玻片溫度波動(dòng)始終≤±1℃，避免了因局部過熱或降溫導(dǎo)致的探針脫靶或背景信號(hào)升高，確保不同玻片間信號(hào)強(qiáng)度一致（變異系數(shù)＜5%）。

• 2. 流程效率：全自動(dòng)變性 - 雜交程序?qū)鹘y(tǒng)手動(dòng)操作所需的 24-30 h 縮短至 18-20 h，且 “開蓋即操作" 的玻片卡槽設(shè)計(jì)減少了人工干預(yù)，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

• 3. 數(shù)據(jù)可溯性：儀器實(shí)時(shí)記錄溫度曲線并支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出，為實(shí)驗(yàn)重復(fù)性驗(yàn)證提供了量化依據(jù)，符合學(xué)術(shù)研究對(duì)質(zhì)控體系的嚴(yán)格要求。

四、結(jié)論

本研究建立了基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的黑麥染色質(zhì) FISH 檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了黑麥特異性序列在體細(xì)胞與減數(shù)分裂細(xì)胞中的精準(zhǔn)定位。該方法克服了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)技術(shù)的局限性，為麥類作物遠(yuǎn)緣雜交育種中異源染色質(zhì)的追蹤、鑒定及遺傳效應(yīng)分析提供了可靠工具。

威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準(zhǔn)控溫、高效流程及智能互聯(lián)優(yōu)勢(shì)，顯著提升了植物染色體 FISH 實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與操作效率。無論是作物遺傳育種中的外源基因定位，還是染色體進(jìn)化研究中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，該儀器均能為科研人員提供高精度、可重復(fù)的檢測(cè)方案。

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