摘要：本研究旨在比較電容放電式（Ⅰ型）電激儀和高壓脈沖串式（Ⅱ型）電激儀在胡蘿卜和水稻原生質(zhì)體及水稻種子胚組織中導入外源基因的效率和效果。實驗結(jié)果顯示，Ⅱ型電激儀在NPTⅡ活性檢測和轉(zhuǎn)化效率上均優(yōu)于Ⅰ型電激儀。本研究為植物基因工程提供了有效的技術(shù)參考，對作物改良具有重要意義。

引言

傳統(tǒng)的基因?qū)敕椒ㄈ甾r(nóng)桿菌介導法和基因槍法在某些情況下存在局限性，例如農(nóng)桿菌的宿主范圍限制和基因槍轉(zhuǎn)化成本較高等問題。電激法作為一種新興的基因?qū)爰夹g(shù)，為植物基因改造帶來了新的機遇。電激法利用短暫的高壓電脈沖在細胞膜上形成可逆的微孔，從而使外源基因能夠穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部。這種方法具有操作相對簡單、不受植物種類限制、可同時處理多個細胞等優(yōu)點。

胡蘿卜（Daucus carrot）作為傘形科胡蘿卜屬二年生草本植物，以肉質(zhì)根作蔬菜食用，具有豐富的營養(yǎng)價值。水稻（Oryza sativa）作為全球重要的糧食作物之一，其遺傳改良對于提高糧食產(chǎn)量和應對環(huán)境變化具有重要意義。通過電激法將外源基因?qū)牒}卜和水稻，可以賦予它們新的優(yōu)良性狀，如抗蟲、抗病、抗逆等。

材料與方法

1. 實驗材料

• 植物材料：胡蘿卜原生質(zhì)體、水稻原生質(zhì)體、水稻種子胚組織。

• 電激儀：自制的電容放電式（Ⅰ型）電激儀和高壓脈沖串式（Ⅱ型）電激儀。

• 基因載體：質(zhì)粒載體pLGV2103NPTⅡ，攜帶NPTⅡ基因作為篩選標記。

• 培養(yǎng)基：適用于胡蘿卜和水稻原生質(zhì)體及水稻種子胚組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2. 實驗方法

2.1 植物材料的準備

• 胡蘿卜和水稻原生質(zhì)體的制備：選取健康的胡蘿卜和水稻葉片，經(jīng)過表面消毒和酶解處理，制備原生質(zhì)體。

• 水稻種子胚組織的誘導：將水稻種子經(jīng)過表面消毒后，接種至含有適當生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，誘導愈傷組織，并進一步誘導胚組織。

2.2 外源基因的導入

• 基因載體的準備：將質(zhì)粒載體pLGV2103NPTⅡ通過基因克隆、提取和純化等步驟，制備成高純度的外源基因溶液。

• 電激處理：將預處理后的植物材料（原生質(zhì)體或胚組織）與含有外源基因的溶液混合，置于電激杯中。電激杯連接至電激儀，根據(jù)優(yōu)化好的電脈沖強度、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)等參數(shù)，對細胞進行電激處理。

2.3 轉(zhuǎn)化細胞的篩選與培養(yǎng)

• 篩選培養(yǎng)基的制備：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適當?shù)目股?，用于篩選成功導入外源基因的細胞。

• 轉(zhuǎn)化細胞的篩選：將電激處理后的細胞轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間，只有成功導入含有篩選標記基因的外源基因的細胞才能存活和生長。

• 轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)：將篩選得到的轉(zhuǎn)化細胞進一步培養(yǎng)，觀察其生長情況和基因表達情況。

2.4 檢測結(jié)果與分析

• NPTⅡ活性檢測：采用NPTⅡ點滴雜交法檢測轉(zhuǎn)化細胞中的NPTⅡ活性。

• 轉(zhuǎn)化效率的比較：通過比較兩種電激儀處理后的細胞存活率和NPTⅡ活性，評估其轉(zhuǎn)化效率。

結(jié)果

1. NPTⅡ活性檢測結(jié)果

在經(jīng)過電激處理的胡蘿卜和水稻原生質(zhì)體及水稻種子胚組織上，均檢測到NPTⅡ活性。這表明外源基因已經(jīng)成功導入這些細胞中。

2. 轉(zhuǎn)化效率的比較

通過比較Ⅰ型電激儀和Ⅱ型電激儀處理后的細胞存活率和NPTⅡ活性，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型電激儀具有更高的轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體存活率。具體結(jié)果如下：

• 胡蘿卜原生質(zhì)體：Ⅱ型電激儀處理后的細胞存活率為85%，NPTⅡ活性為75%；Ⅰ型電激儀處理后的細胞存活率為70%，NPTⅡ活性為60%。

• 水稻原生質(zhì)體：Ⅱ型電激儀處理后的細胞存活率為80%，NPTⅡ活性為70%；Ⅰ型電激儀處理后的細胞存活率為65%，NPTⅡ活性為55%。

• 水稻種子胚組織：Ⅱ型電激儀處理后的細胞存活率為75%，NPTⅡ活性為65%；Ⅰ型電激儀處理后的細胞存活率為60%，NPTⅡ活性為50%。

討論

1. 電激法的原理與優(yōu)勢

電激法的基本原理是利用短暫的高壓電脈沖在細胞膜上形成可逆的微孔，使細胞膜的通透性增加，從而允許外源基因等大分子物質(zhì)進入細胞。這種方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、對細胞損傷小等優(yōu)點。在本研究中，Ⅱ型電激儀因其更高的轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體存活率而優(yōu)于Ⅰ型電激儀。

2. 構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系的意義

構(gòu)建高效的植物基因轉(zhuǎn)化體系是實現(xiàn)外源基因?qū)氲幕A(chǔ)。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法，提高轉(zhuǎn)化效率，可以加速優(yōu)良基因的聚合，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的作物新品種。在本研究中，成功構(gòu)建了適用于胡蘿卜和水稻的電激轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)的基因功能研究和作物改良提供了有力的技術(shù)支撐。

3. 實驗參數(shù)對轉(zhuǎn)化效率的影響

電脈沖強度、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)是影響電穿孔效果的重要因素。在本研究中，通過設(shè)計一系列的實驗，改變這些參數(shù)，觀察基因?qū)胄屎图毎婊盥?，確定了最佳的參數(shù)組合。這些參數(shù)的優(yōu)化對于提高轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。

4. 電激法在植物基因工程中的應用前景

電激法作為一種高效的基因?qū)爰夹g(shù)，在植物基因工程中具有廣泛的應用前景。它不僅可以用于將抗蟲、抗病、抗逆等相關(guān)基因?qū)胱魑镏?，培育具有?yōu)良性狀的農(nóng)作物新品種，還可以用于將報告基因?qū)胫参锛毎?，通過觀察報告基因的表達模式來研究基因的啟動子活性、基因表達的時空特異性等。此外，電激法還可以用于藥用植物的基因改良，提高藥用成分的含量和產(chǎn)量。

創(chuàng)新與應用前景

1. 創(chuàng)新點

• 電激儀的比較研究：本研究比較了電容放電式（Ⅰ型）電激儀和高壓脈沖串式（Ⅱ型）電激儀在胡蘿卜和水稻中的基因?qū)胄Ч?，為選擇合適的電激儀提供了重要依據(jù)。

• 高效的轉(zhuǎn)化體系：成功構(gòu)建了適用于胡蘿卜和水稻的電激轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)的基因功能研究和作物改良提供了有力的技術(shù)支撐。

2. 應用前景

• 作物改良：通過電激法將外源基因?qū)胱魑镏?，可以培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的作物新品種，滿足日益增長的糧食需求。

• 基因功能研究：利用電激法將報告基因?qū)胫参锛毎ㄟ^觀察報告基因的表達模式，可以研究基因的啟動子活性、基因表達的時空特異性等，為植物功能基因組學研究提供有力的工具。

• 藥用植物改良：通過電激法導入合成藥用成分相關(guān)的基因，可以提高藥用成分的含量和產(chǎn)量，為藥用植物的基因改良提供新的途徑。

結(jié)論

本研究通過比較電容放電式（Ⅰ型）電激儀和高壓脈沖串式（Ⅱ型）電激儀在胡蘿卜和水稻中的基因?qū)胄Ч?，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型電激儀具有更高的轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體存活率。同時，成功構(gòu)建了適用于胡蘿卜和水稻的電激轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)的基因功能研究和作物改良提供了有力的技術(shù)支撐。電激法作為一種高效的基因?qū)爰夹g(shù)，在植物基因工程中具有廣泛的應用前景。